Analisi della Vitamina C negli agrumi

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Determinazione della Vitamina C (acido ascorbico)

Ho tratto da un articolo del Journal of Chemical Education (J. Chem. Educ. 2019, 96, 2578−2583) questa interessante esperienza di laboratorio il cui scopo è la determinazione del contenuto di Vitamina C in campioni di alimenti, integratori vitaminici, medicinali ecc. mediante la tecnica spettrofotometrica. Lo studente con questa analisi utilizza campioni di prodotti a lui familiari e questo rappresenta una motivazione ulteriore.

Vitamina C

La vitamina C è un cofattore vitaminico alimentare che si trova comunemente negli agrumi e nelle verdure verdi. La  sua struttura è simile allo zucchero ed è stato scoperto che aumenta l’assorbimento del ferro nell’intestino tenue. La carenza di vitamina C può causare lo scorbuto, ma è stato riscontrato che la presenza costante di vitamina C nella dieta delle persone riduce la frequenza e la gravità dei raffreddori. La vitamina C è anche chiamata acido ascorbico o ascorbato e molti integratori alimentari contengono acido ascorbico o uno dei suoi derivati, come l’ascorbato di calcio o l’ascorbato di sodio

La struttura in 3D

L’esperienza può essere una occasione per affrontare il tema della funzione delle vitamine, in particolare la vitamina C, come anche le  patologie legate alla loro penuria nei paesi poveri;  all’opposto nei paesi ricchi si può arrivare ad un sovradosaggio con l’uso di integratori alimentari , con conseguenze anche negative per la salute. Una problematica socio-sanitaria che ha vari risvolti.

Principi del metodo analitico

Il complesso colorato, che è stato utilizzato nei metodi proposti precedentemente, tra Fe⁺² e 2,2′-bipiridile, Fe[(bpy)3]²⁺, continua ad essere utilizzato in questa analisi , ma nell’approccio presentato qui, viene impiegato un protocollo in due fasi in cui prima la reazione redox tra acido ascorbico (vitamina C) e cloruro ferrico forma lo ione cloruro ferroso. Successivamente, vengono aggiunte quantità saturanti del chelante 2,2′-bipiridile per creare un forte cambiamento colorimetrico visivamente distinto con il Fe⁺² (Figura 1A). Questa reazione provoca un vivace cambiamento di colore dal rosso scuro al giallo chiaro su un’ampia gamma di concentrazioni di vitamina C (Figura 1B). Il saggio rispetto ai precedenti, riportati in letteratura, presenta il vantaggio di essere più semplice, sicuro e veloce.

Figura 1

(A) La formazione del complesso rosso arancione Fe[(bpy)3]²⁺ avviene in due fasi. Innanzitutto, la vitamina C riduce gli ioni Fe³⁺ a Fe^2+. Solo la forma bivalente del ferro, Fe²⁺, può formare un complesso ② con 2,2′-bipiridile, generando il complesso cromogenico Fe[(bpy)3]²⁺.

(B) La reazione produce un vivace cambiamento di colore visibile dal rosso scuro al giallo pallido su più ordini di grandezza che vanno da 7,2 mg/mL a 28 μg/mL di vitamina C.

(C) Il cambiamento di colore visivo in (B) si traduce in una funzione sigmoidale con un intervallo lineare compreso tra circa 25 e 300 μg/mL (regione ombreggiata in arancione), in cui la formazione di un colore rosso è funzione lineare della quantità di vitamina C presente.

(D) Per determinare meglio l’intervallo lineare del test, è stata eseguita un’ulteriore analisi all’interno dell’intervallo di concentrazione 25 e 300 μg/mL, riscontrando che la reazione si adattava alla retta y = 0,0145x + 0,0733 (R2 = 0,9653) e il test degli studenti è stato progettato all’interno di questo intervallo, coerentemente con la legge di Beer.

La lunghezza d’onda scelta per lo spettrofotometro

Lo spettrofotometro è impostato per registrare l’assorbimento della luce a una lunghezza d’onda di 525 nm.

OBIETTIVI

1. Utilizzare metodi colorimetrici per creare una curva standard di concentrazioni note di vitamina C.
2. Applicare la curva standard per calcolare la concentrazione di vitamina C in soluzioni sconosciute.
3. Utilizzare il foglio Excel per la costruzione della retta di taratura

Soluzioni

0,05% 2,2′-Bipiridile          N. CAS 366-18-7

Il 2,2′-bipiridile è poco solubile in acqua e alte percentuali di etanolo possono causare precipitati nel saggio modificato. Per ottenere una soluzione di 2,2′-bipiridile allo 0,05% opportunamente formulata:

• Sciogliere 0,005 g per 1 ml di etanolo.
• Diluire 3 ml di questa soluzione in 27 ml di acqua sterile (vol. sufficiente per le analisi)

La soluzione è sensibile alla luce , schermarla una volta preparata.

0,01% di cloruro di ferro (III)      N.CAS 7705-08-0

Una soluzione diluita di cloruro di ferro (III) è utile in questo laboratorio per la sicurezza e un cambio di colore efficace. Per preparare la soluzione di cloruro di ferro (III):

• Sciogliere 0,01 g per 1 ml di acqua
• Diluire per un fattore di 100 prima della sperimentazione (questo reattivo può essere preparato per tutti i gruppi di studenti)

Soluzione stock di vitamina C      N. CAS 50-81-7

La soluzione madre per la creazione della curva standard può essere preparata a conc. 500 μg/mL per una linearità ottimale. Il volume dipende dalle quantità usate per preparare la soluzione standard (vedi di seguito).

Creazione della curva standard

1. Preparare una soluzione madre di vitamina C da 500 μg/ml
2. Preparare per diluizione della soluzione madre le soluzioni standard a concentrazione nota.

Supponiamo di avere in dotazione pipette graduate di precisione da 0,5 mL – 1 ml – 2 mL con gradazione 0,01 mL

Alle sei provette, contrassegnare C1 – C6, aggiungere quanto segue di ciascuna soluzione (preparate prima come visto precedentemente) nell’ordine seguente e come indicato nella tabella seguente (mescolare pipettando su e giù per rendere la miscela uniforme).

L’analisi va eseguita subito dopo aver completato la preparazione della miscela. 

N.B. A seconda delle disponibilità di ciascun laboratorio in termini di pipette graduate possono essere preparati volumi diversi (maggiori o minori) in funzione della sensibilità delle pipette a disposizione. Importante nella preparazione delle soluzioni standard di rispettare il rapporto 1:1:5 tra i tre componenti.

Elaborazione dati con foglio Excel

Una tipica curva standard, ripresa dall’articolo del JCE, che si ottiene prende la seguente forma:

La linearità è compresa nell’intervallo 50-300 μg/mL.  I dati di assorbanza ottenuti, dei campioni standard, sono riportati in un foglio Excel. Si ricava l’equazione della retta, che sarà utilizzata per determinare le concentrazioni di vitamina C nei campioni incogniti.

Campioni su cui determinare il contenuto di vitamina C

 La scelta dei campioni merceologici può essere molto varia, si va dalle formulazioni vitaminiche in polvere e pasticche, ai diversi tipi di frutta e ortaggi contenenti quantità variabili di Vitamina C. Alimenti che presentano qualche vantaggio pratico per l’analisi possono essere il succo di limone, di arancio e il succo d’uva. Se due giorni  prima viene preparata dagli studenti a casa una spremuta di arancia o di limone e riposta nel frigo, quando viene effettuata l’esperienza di  laboratorio, può essere fatto il confronto tra il contenuto di vitamina di un succo fresco e quello preparato dagli studenti  nei due giorni precedenti (per l’estrazione del succo a casa gli studenti seguiranno la procedura che segue, potranno usare solo acqua minerale e non distillata, ma questo non influenza in modo significativo i risultati)

Il contenuto di vitamina C è mediamente per i succhi

Arancio, succo                                              44 mg/100g

Limone, succo                                               43 mg/100g

L’agrume viene spremuto con un semplice spremiagrumi casalingo.  Si può usare metà dell’agrume di cui si conosce il peso rispetto all’intero. Alla coppetta rimasta non edibile, dopo la prima spremitura, vengono aggiunti 2-3 mL di acqua distillata e ripetuta nuovamente l’operazione di spremitura. L’operazione va condotta più volte fino a estrarre la quasi totalità del succo. Tutti le porzioni di liquido raccolte nello spremiagrumi sono riunite nello stesso contenitore. Lo spremiagrumi viene lavato con piccole porzioni di acqua, che sono riunite alle precedenti.  IL volume della spremitura viene portato a 100 mL se ricavato da mezzo agrume o 200 -250 mL per un agrume intero, per rientrare nel range delle concentrazioni di lavoro.  Se la decantazione non è sufficiente a chiarificare il succo, si preleva una aliquota per l’analisi e si sottopone a centrifugazione.

I valori di assorbanza dei campioni sono inseriti nella equazione della retta di taratura per ricavare la concentrazione incognita.

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